不同產(chǎn)地和變型天麻藥材的質(zhì)量及其硫磺熏蒸前后的變化

　　[摘要]：天麻作為硫磺熏蒸較為嚴重的品種之一，其藥材質(zhì)量問題受到人們高度關(guān)注。該文利用全國8個主產(chǎn)區(qū)和3種主要變型天麻樣品，基于UPLC-Q-TOF-MS/MS探討不同產(chǎn)地和變型天麻藥材的質(zhì)量及其硫磺熏蒸前后的變化。結(jié)果表明，硫磺熏蒸處理后，天麻藥材中除了巴利森苷E含量升高外，天麻素、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷C這4種成分含量均降低，并且產(chǎn)生了一種新的硫熏標志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite。相比于產(chǎn)地來說，不同變型的天麻藥材質(zhì)量差異更大，尤其以紅天麻和烏天麻的質(zhì)量差異最為明顯。此外，吉林產(chǎn)地的紅天麻與其他產(chǎn)地的天麻在天麻素和巴利森苷類成分含量上最低，這可能與其種植方式和氣候環(huán)境等因素有關(guān)。綜合來看，硫磺熏蒸前后天麻質(zhì)量差異要比不同產(chǎn)地和變型對藥材質(zhì)量的影響更明顯，這主要歸因于產(chǎn)生了新的硫熏標志物。

　　[關(guān)鍵詞]：硫磺熏蒸天麻產(chǎn)地變型質(zhì)量評價

　　天麻又名赤箭、定風(fēng)草、獨搖芝[1]，為蘭科多年生植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，藥食兩用，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，被譽為“治風(fēng)之神藥”，可用于治療小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、頭痛眩暈、風(fēng)濕痹痛等癥[2]。天麻的化學(xué)成分主要有酚類及其苷類、有機酸類、甾醇類和多糖類，其中酚類及其苷類是天麻的主要活性成分，如天麻素和對羥基苯甲醇[3-5]。20世紀70年代天麻由野生變栽培后，栽培天麻成為主要商品來源，其種植主產(chǎn)地主要分布在云南、四川、貴州、湖北、陜西、河南等地[6]。此外，根據(jù)天麻莖桿顏色又可分為紅天麻、烏天麻和烏紅天麻等不同變型[7]。

　　近年來，硫磺熏蒸加工方法在中藥材的初加工和貯藏環(huán)節(jié)應(yīng)用普遍，主要起到干燥、防腐、漂白、延長貯藏期的作用[8-9]。但是硫熏過量不僅會殘留大量二氧化硫，還會嚴重影響藥材質(zhì)量[10-12]。硫熏天麻在全國各產(chǎn)區(qū)是普遍存在的，成為硫熏較為嚴重的品種之一[13]，其質(zhì)量問題受到人們廣泛關(guān)注。然而目前還沒有一種成熟有效的可替代硫磺熏蒸的方法。目前已有大量關(guān)于硫磺熏蒸對天麻藥材質(zhì)量的研究[14-16]，然而結(jié)合不同產(chǎn)地和變型對天麻硫熏前后藥材質(zhì)量變化的研究卻鮮有報道。本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和代謝組學(xué)對全國主產(chǎn)地和主要變型的天麻藥材質(zhì)量及其硫磺熏蒸前后變化進行探討，為全國天麻藥材質(zhì)量評價和硫熏對藥材質(zhì)量影響提供參考。

　　1 材料和方法

　　1.1 樣品

　　新鮮天麻樣品分別采自云南昭通、貴州大方、湖北宜昌、四川廣元、安徽大別山、陜西漢中、河南鄭州和吉林撫松8個產(chǎn)地，包括烏天麻、紅天麻和烏紅雜交天麻3種變型，即有11份天麻樣品，采集時間為2016年11月。經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郭蘭萍研究員鑒定為蘭科植物天麻G.elata的干燥塊莖，憑證標本存放于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。具體樣品信息見表1。

　　1.2 儀器和試劑

　　ACQUITY UPLCTM H-Class系統(tǒng)(美國Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、EmpowerTM3色譜工作站)，Waters Xevo G2-S QTOF-MS質(zhì)譜系統(tǒng)(美國Waters公司)，BSA224S型分析天平(德國Satorius公司)，Eppendorf 5810R離心機(德國Eppendorf公司)。

　　對照品天麻素(中國食品藥品檢定研究院，批號110807-201507)，巴利森苷A(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號15082302)，巴利森苷B(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號15082013)，巴利森苷C(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號15082012)，巴利森苷E(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號15081606)，蘆丁(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號140225)。乙腈(色譜純，德國Merck公司)，甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)，Milli-Q超純水，其他試劑均為分析純。

　　1.3 天麻硫磺熏蒸處理

　　天麻樣品分為對照組和處理組，其中對照組為不經(jīng)硫磺熏蒸的新鮮天麻，處理組為硫磺熏蒸處理的天麻。采用課題組前期的硫熏方法，硫磺用量與藥材用量比例為1∶20[17]，以保證藥材徹底熏透。處理組具體操作：取新鮮洗凈的天麻樣品，蒸制10~20min，經(jīng)蒸透斷面無白心后，取出晾干表面水分。仿照產(chǎn)地農(nóng)民熏蒸過程，取新鮮天麻放置在自制塑料箱上層，箱體兩側(cè)各開一小口，將硫磺放置在瓷盤中，點燃后放置在塑料箱下層，蓋上頂蓋。硫磺熏蒸2h后取出，50℃烘干，打粉備用。經(jīng)過硫熏處理后，所有產(chǎn)地和變型的11份天麻均得到一一對應(yīng)的硫熏和未硫熏樣品，即22批處理后的樣品，每批樣品均為5個單株重復(fù)。

　　1.4 樣品溶液制備

　　1.4.1 對照品溶液制備

　　精密稱取適量5種天麻對照品，加50%甲醇分別制成單個對照品儲備液，再分別精密量取各對照品儲備液適量，制成混合對照品溶液，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4.2 供試品溶液的制備

　　精密稱取天麻藥材粉末0.05g(過60目)，加入50%甲醇2mL(內(nèi)含蘆丁內(nèi)標物質(zhì))，室溫下超聲提取(功率120W，頻率40kHz)60min，放置室溫，補足失重，樣品提取液13000r·min-1離心10min后，取上清液過0.2μm微孔濾膜，供UPLC-Q-TOF-MS分析用。

　　1.5 液相和質(zhì)譜條件

　　1.5.1 液相色譜條件[18-21]

　　ACQUITY UPLCR HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm，美國Waters公司);流動相為0.1%甲酸-水溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈(B);梯度洗脫(0~4min，0%~0.5%B;4~6min，0.5%~2%B;6~7min，2%~8%B;7~12min，8%~12%B;12~18min，12%~20%B;18~24min，20%~40%B;24~25min，40%~45%B;25~31min，45%~70%B;31~33min，70%~98%B;33~35min，98%B);流速0.5mL·min-1;柱溫40℃，進樣體積1μL。

　　1.5.2 質(zhì)譜條件

　　Waters Xevo G2-S QTOF-MS質(zhì)譜采用電噴霧離子化源(ESI)，采用負離子檢測模式;掃描范圍m/z50~1500，掃描時間0.2s，毛細管電壓2000V，錐孔電壓40V，除溶劑氣體氮氣900L·h-1，除溶劑溫度450℃，離子源溫度100℃。

　　1.6 天麻藥材5個指標成分的相對定量分析

　　課題組在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)以蘆丁作為內(nèi)標物不僅響應(yīng)較好，而且在其出峰位置處無干擾，成功實現(xiàn)了相對定量分析[17]。本研究以蘆丁(20.8mg·L-1)作為內(nèi)標物，提取各天麻樣品中5個分析物的峰面積與蘆丁峰面積的比值，計算得到5個指標成分的相對含量，用于天麻樣品間的相互比較。

　　1.7 數(shù)據(jù)處理

　　本研究采用MassLynxTM軟件(4.1，美國Waters公司)對天麻化學(xué)成分進行分析，根據(jù)保留時間、精確相對分子質(zhì)量、對照品和同位素的豐度和分布對目標化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。為了準確鑒定化合物，分子式的參數(shù)設(shè)定：C[0~80]，H[0~150]，O[0~60]，N[0~10]，S[0~2]，P[0~2]，質(zhì)譜偏差設(shè)置為5×10-6。同時，使用內(nèi)標物蘆丁和天麻混合樣品分別進行相對定量和質(zhì)量控制(QC)。接下來尋找天麻藥材中的硫熏特征性差異成分，將前面采集得到的數(shù)據(jù)再依次導(dǎo)入Progenesis QI軟件(美國Waters公司)和EZinfo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

　　2 結(jié)果

        硫磺熏蒸對天麻藥材質(zhì)量的影響

　　根據(jù)分子離子峰響應(yīng)強度判斷，硫熏后天麻藥材中的天麻素和巴利森苷成分明顯降低，見圖1。推測天麻藥材中各成分的變化可能是在二氧化硫和水形成的酸性環(huán)境下，發(fā)生降解，亞磺酸化或氧化還原反應(yīng)的結(jié)果。此外，從圖1B可以發(fā)現(xiàn)，硫熏后的天麻樣品中產(chǎn)生了新的成分。根據(jù)其質(zhì)譜信息，結(jié)合其裂解碎片，發(fā)現(xiàn)該成分與課題組前期得到的天麻硫熏標志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite(p-HS)相一致[17-18]，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

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